مبداء عمل جهاز Spectrophotometer

مبداء عمل جهاز Spectrophotometer
-----------------------
د/ يونس الأهدل
---------------------------
-- كيف تكون مبدعا في شغل الكيمياء...
=================
❇تعتمد فكرة تحاليل الكيمياء عموما على تحويل ترىكيز المادة التي نريد قياسها إلى لون أو حركة ، لون في الكولرميتريك وحركة في الكينيتيك ، ثم قياس كثاف ة ذلك اللون بطريقة الكولرميتريك أو مقدار التغير في معدل التفاعل بطريقة الكينيتيك.
كثافة اللون أو معدل التفاعل يطلق عليهما اسم الامتصاصية absorbance والتي تعبر عن القدر الذي امتصه المحلول من الشعاع الضوئي داخل الجهاز.
الامتصاصية absorbance تتناسب طرديا مع تركيز المادة التي نريد قياسها.
ـــــــــــ
كيف سنقيس الـ absorbance ؟
لابد من استخدام فلتر مناسب بحيث يكون لون الشعاع مناسب للون المحلول المراد قياسه. لأن ألوان الطيف متقابلة ، كل لون يمتص اللون المقابل له في الطول الموجي. الأحمر يمتص الأخضر والأخضر يمتص الأحمر، بينما الأحمر لا يمتص الأحمر والأخضر لا يمتص الأخضر وهكذا
إذا كان لون المحلول أحمر نختار اللون المقابل للون الاحمر حسب ألوان الطيف وهو اللون الأخضر الفوسفوري الذي ينتج عند استخدام فتر 546 .
الفلتر يُذكر في الكت التي تستخدمها، لكن لابد أن يكون عندك علم ببعض الأساسيات التي ستفيدك في التعامل مع الأجهزة.
مثلا، الفلتر 546 يرسل شعاع لونه أخضر فوسفوري يشبه بالضبط لون محلول الهيموجلوبين وهو بالضبط نفس درجته، وبالتالي فلن يمتص محلول الهيموجلوبين منه أي قيمة يمكن قياسها بالأرقام العشرية الثلاثة بعد العلامة. أي أن محلول الهيموجلوبين سيظهر في الجهاز وكأنه عديم اللون كالماء المقطر بالضبط . أي أننا إذا أدخلنا للجهاز blank ماء مقطر ثم قرأنا عليه محلول الهيموجلوبين على فلتر 546 فإنه لابد أن يعطي 0.000 ، في حالة أعطى نتيجة غير تلك النتيجة نعلم أن هناك شيء غير مضبوط في المحلول أو الجهاز .
مثال آخر من فوائد معرفة الألوان: فلتر 623 يرسل شعاع لونه أحمر ، وبالتالي هذا الشعاع لن يقرأ أي قيمة للون الأحمر الناتج من الهيموليسس . أي أنني يمكنني قراءة العينات التي فيها تكسير لكرات الدم عليه دون أي خوف من تداخل لون الهيموليسس . فإذا كان عندي كت مثلا للكالسيوم تستخدم على هذا الفلتر فأنا أفضلها على غيرها لتفادي الهيموليسس . كذلك باقي العناصر يفضل قياسها على هذا الفلتر للهروب من الهيموليسس ، وهكذا.
ـــــــــ
في حالة لم تحدد الكت فلتر بعينه وحددت مدى من الطول الموجي ، على أي أساس يتم اختيار الفلتر المناسب على جهازك ؟
وعموما، كيف يتم اختيار الفلتر المناسب ؟
لاختيار الفلتر المناسب لتحليل ما لابد من تحضير انبوبة standard وقراءتها على الفلاتر الداخلة في المدى المتاح ، ويحدد الفلتر المناسب وهو الذي يعطي أعلى قراءة standard بعد التصفير على الـ blank على نفس الفلتر.
ملحوطة، كلما زادت قراءة standard قل الفاكتور ، فإذا كنت ستقرأ الاستاندر على برنامج معد لهذا التحليل وليس على برنامج قياس absorbance ، في هذه الحالة تختار الفلتر الذي يعطي أقل فاكتور .
الفاكتور = تركيز standard مقسوما على قراءة absorbance الخاصة به ( سيأتي توضيح هذا قريبا ) .
ـــــــــــــ
بعد أن علمنا كيفية قياس الـ absorbance لمحلول ما وعلمنا كيف نختار الفلتر المناسب ، الآن يجب أن نسأل: كيف نميز القراءة الناتجة عن التفاعل من باقي الألوان المتداخلة في العينة كلون الكاشف ولون العينة ؟
الإجابة:
عندما نقرأ الأنبوبة التي فيها التفاعل مباشرة فإن القراءة التي يعطيها الجهاز تكون في الحقيقة مجموع لأكثر من لون وهي:
قراءة أنبوبة العينة = قراءة اللون الناتج عن التفاعل + قراءة الكاشف + قراءة لون السيرم في حال كان له لون مؤثر
نحن نريد قراءة اللون الناتج عن التفاعل فقط لذلك لابد من التخلص من أي قراءات أخرى متداخلة في الانبوبة التي فيها العينة.
كيف سنتخلص من هذه الألوان ؟
عن طريق عمل أنبوبة أخرى تحتوي على الألوان المتداخلة مع اللون الناتج عن التفاعل ، هذه الأنبوبة تسمى blank وهذه الكلمة تعني "صفر" أي أننا عندما نطرح قراءة هذه الأنبوبة من قراءة أنبوبة العينة فإن الألوان المتداخلة ستخصم من قراءة أنبوبة العينة ولن تسبب أي زيادة في القراءة.
الـ blank : هي أنبوبة فيها كل ما في أنبوبة التفاعل إلا أنها لا يوجد فيها أحد مسببات التفاعل حتى لا تتساوى مع أنبوبة العينة.
تسمىreagent blank في حالة احتوت على الكواشف فقط ، وتسمى sample blank في حالة احتوت على جزء من العينة مع الكاشف .
وربما نحتاج أنبوبتين : أنبوبة للكاشف وأخرى للعينة ثم نجمعهما ونطرحهما من القراءة الكلية لأنبوبة العينة.
وبيان ذلك:
أولا: حالات نستخدم فيها reagent blank :
1- في حالة كان التحليل عبارة عن كاشف واحد يضاف عليه العينة كتحليل السكر أو UA مثلا : يكون البلانك هو نفس الكاشف فقط ( يفضل إضافة ماء مقطر بنفس حجم العينة وإن كان في الحقيقة لن يكون مؤثرا)
2- في حالة كان التحليل يستخدم فيه عدة كواشف كاليوريا مثلا : يكون البلانك هو نفس الكواشف المستخدمة في أنبوبة العينة مع مراعاة نفس الأحجام والترتيب ونفس ظروف التحضين .
3- في حالة كان للعينة لون غير مؤثر ( في ظروف قراءة التفاعل ) يمكن إهماله : مثل لون الهيموليسس إذا كان التحليل يتم قراءته على فلتر 623 لأن هذا الفلتر لا يقرأ اللون لون الهيموليسس . أي أن الهيموليسس على هذا الفلتر كأنه لا لون له .
( ملحوظة: إذا كان في العينة هيموليسس نطلب عينة أخرى فإن تعذر ذلك وكان غير مؤثر كما سبق فلا مانع من اجراء التحليل )
ثانيا : حالات نستخدم فيها sample blank :
في حالة كان للعينة لون ناتج عن الهيموليسس (وتعذر الحصول على عينة أخرى) أو الصفراء وكان لون العينة يتم قراءته على الفلتر المستخدم لهذا التحليل فإنه لابد من عمل sample blank بما يناسب التفاعل ،
وبيان تلك الحالات:
1- تحليل يدخل فيه أكثر من كاشف ويمكن الاستغناء عن أحد تلك الكواشف لأنه عديم اللون ( مثل تحليل الصفراء ) : في هذه الحالة نضع كل الكواشف في أنبوبة البلانك عدا أحد الكواشف تحديدا R2 وذلك لأنه غير مؤثر كلون ولا كحجم ، وعند عدم استخدامه لا يحدث تفاعل في أنبوبة البلانك فيمكننا أن نصفر الجهاز على تلك الأنبوبة .
2- في حالة كان المستخدم في التفاعل كاشف واحد أو عدة كواشف لا يمكن الاستغناء عنها فإن عمل الـ sample blank سيحتاج خطوتين ، لأنه لو وضعنا العينة في الكاشف في أنبوبة البلانك فإنه سيحدث تفاعل وستكون مثل أنبوبة العينة تماما.
مثال: تحليل UA
في هذه الحالة :
قراءة أنبوبة العينة = قراءة اللون الناتج عن التفاعل + قراءة الكاشف + قراءة لون السيرم في حال كان له لون مؤثر
سنتعامل مع هذه العينة كالآتي :
** إذا كان القياس يتم على برنامج الـ absorbance : نقوم بتحضير ثلاثة أنابيب ، أنبوبة فيها الكاشف فقط وأنبوبة فيها ماء مقطر بنفس الحجم المستخدم من الكاشف ونضع فيها جزء من السيرم بنفس الحجم المستخدم من العينة .
نصفر على ماء مقطر ، ثم نقيس الكاشف ونقيس الماء المقطر بما فيه من عينة ثم نقيس أبنوبة العينة .
ثم نطبق في المعادلة:
قراءة اللون الناتج عن التفاعل = قراءة أنبوبة العينة – (قراءة الكاشف + قراءة لون السيرم )
بهذه الطريقة حصلنا على اللون الناتج عن التفاعل فقط.
** إذا كان القياس يتم على برنامج مخصص للتحليل ( مثالنا UA) : نقوم بتحضير نفس الأنابيب السابقة .
نصفر على الكاشف ، ثم نقيس انبوبة العينة فيعطينا تركيز مثلا 10 .
بعدها نعيد إدخال بلانك عبارة عن ماء مقطر ، وندخل الاستاندر ، ثم نقيس الأنبوبة التي فيها الماء المقطر والعينة كتركيز ، فإذا أعطى مثلا 2 نقوم بطرح هذه القيمة من القيمة التي أعطتها أنبوبة العينة والتي كانت 10 فيكون في النهاية تركيز الـ UA لهذه الحالة : 10 – 2 = 8
*إذا كان المحلول المستخدم عديم اللون فإن ال sample blank سيكون ماء مقطر نضع فيه العينة فقط لأنه لا يوجد لون للمحلول نحتاج طرحه.
وإذا كان القياس على برنامج ال UA فإننا نقيس أنبوبة العينة ثم نقيس أنبوبة البلانك ونطرح قيمتها .
ـــــــــــــ
الآن بعد أن عرفنا كيف نحدد بالضبط قراءة اللون الناتج عن تفاعل العينة مع الكاشف، كيف سنحدد تركيز المادة المراد قياسها في العينة ؟
تركيز المادة في العينة يتناسب طرديا مع شدة اللون وشدة اللون تتناسب طرديا مع الامتصاص ، وبالتالي التركيز يتناسب طرديا مع قراءة absorbance التي تظهر على الجهاز .
كيف سنحول تلك القراءة الى تركيز معلوم ؟
لتحديد تركيز المادة في العينة لابد من مقارنة absorbance الخاصة بها بالـ absorbance الخاصة بمادة معيارية معلومة التركيز standard . بمعنى أننا سنستخدم محلول معلوم التركيز ونعامله نفس معاملة العينة بالضبط ثم نقرأ له الـ absorbance وبعدها نقارن عن طريق ضرب الطرفين والوسطين كالآتي :
Conc. (stand) ----------- absorbance (stand)
Conc. (sample) ----------- absorbance (sample)
عندنا تركيز الاستاندرد معلوم ، وقراءته سنحصل عليها من الجهاز ، وكذلك سنحصل على قراءة السامبل من الجهاز وبالتالي لم يعد إلا مجهول واحد وهو تركيز العينة، ويحسب بضرب الوسطين والطرفين كالآتي:
Conc. (sample) = absorbance (sample) * Conc. (stand) مقسوما على absorbance (stand)
ــــــــــــــ
ما هو الـ Factor وكيف يتم حسابه ؟
بما أن تركيز الاستاندر ثابت وقراءته أصبحت معلومة فإنه من الممكن من حساب معامل ثابت factor منهما وهذا بالضبط ما يفعله الجهاز .
Factor = Conc. (stand) مقسوما على absorbance (stand)
هناك بعض التحاليل التي لا يمكن توفير استاندرد لها لغلو سعره أوعدم ثباته أو لسبب آخر فتقوم الشركات المصنعة بقياس الـ absorbance لمحلول معلوم القيمة بالضبط standard ثم بقسمة التركيز على القراءة تحدد الـ Factor وترفقه بالكت الخاصة بها . يتم هذا القياس في ظروف معيارية تامة .
ــــــــــــــــ
فيم تفيد معرفة طريقة حساب الفاكتور؟
** معرفة الطريقة التي يتم بها حساب الفاكتور تفيدك إذا كنت تستخدم استندرات سريعة التغير . يمكنك تحديد الفاكتور ثم تثبيته وإعادة تحديده كل مدة أو كلما تحس بتغير درجات الحرارة . إذا كنت تقوم بالتحاليل في درجة 37 مئوية وتثبت درجة حرارة الغرفة عن طريق مكيف فلن تحتاج لتغيير الفاكتور الا على فترات بعيدة بسبب كثرة فتح وأغلاق المحاليل.
** ويمكنك استخدام محلول كونترول أو عينة معلومة التركيز بشكل مؤكد بدلا من الاستاندر .
** يمكنك أيضا السير في الاتجاه المعاكس، بمعنى أنه يمكنك تحويل برنامج بعض التحاليل من فاكتور إلى استاندر كما في الهيموجلوبين . لعمل ذلك :استخدم عينة معلومة كاستاندر .
** كذلك يمكن تعيين فاكتور لأي تحليل (الهيموجلوبين مثلا) بحيث يكون الفاكتور مناسب تماما لجهازك وأدواتك ، لعمل ذلك :استخدم عينة معلومة لحساب الفاكتور المناسب لجهازك وماصتك و أدواتك . وذلك بأن تقوم بعمل عدة أنابيب منها ثم قراءة الـ absorbance وأخذ متوسط لكل الأنابيب ثم تطبق في المعادلة الخاصة بحساب الفاكتور:
Factor = Conc. (stand) مقسوما على absorbance (stand)
تقسم القيمة المعلومة للعينة على متوسط قراءتها فتحدد الفاكتور المناسب لجهازك .
** نستخدم معرفتنا بالفاكتور في عمل manual caibration على جهاز الـ CBC أو الكيمياء واختيار فاكتور التعديل بسرعة ودقة :
كما هو معلوم ومتعارف عليه فمشغل جهاز الـ CBC يقوم باستمرار باختبار دقة جهازه خاصة عندما يقوم بتغيير أحد المحاليل ، ويستخدم لهذا الاختبار كونترول أو عينة معلومة القيم فحصها على جهازه قبل تغيير المحلول أو فحصها على جهاز آخر موثوق منه.
في كل الأحوال إذا كانت هناك تغير غير مقبول في نتيجة الهيموجلوبين أو الصفائح أو العد الأبيض أو الأحمر أو MCV ، فإنه يقوم بفتح قائمة manual caibration ثم يقوم بتعديل الفاكتور الخاص بالعنصر المختلف ، يقوم بتعديل النسبة المئوية مرة بعد مرة ، وفي كل مرة يدخل نفس العينة ويقارن نتيجتها حتى تصبح النتيجة مثل النتيجة الموثوق فيها .
أمر طويل نسبيا وقد لا يصل للدقة المطلوبة بالضبط.
هناك معادلة سهلة يمكن إجراؤها لتعديل الفاكتور بسرعة ودقة أكبر، تُحسب كالآتي :
الفاكتور الحالي ...... القيمة المقروءة على الجهاز
الفاكتور الحقيقي المراد ....... القيمة الحقيقية للعينة
بضرب الطرفين والوسطين :
الفاكتور الحقيقي المراد = الفاكتور الحالي * القيمة الحقيقية للعينة / القيمة المقروءة على الجهاز
مثال : الهيموجلوبين يعطي 11.0 وقيمته الحقيقية المعلومة 10.6 ، نفتح الـ manual caibration لنعرف ما هو الفاكتور الحالي القديم فإذا كان مثلا 100% نطبق في المعادلة كالآتي :
الفاكتور الحقيقي المراد = الفاكتور الحالي * القيمة الحقيقية للعينة / القيمة المقروءة على الجهاز
الفاكتور الحقيقي المراد = 100 * 10.6 / 11.0 = 96%
نقوم بتغيير الفاكتور من 100 إلى 96 .
** لتعديل فاكتور الهيموجلوبين على جهاز الكيمياء بهذه المعادلة :
مثال : الهيموجلوبين يعطي 11.0 وقيمته الحقيقية المعلومة 10.3 ، والجهاز مبرمج على الفاكتور المشهور 36.77 .
نقوم بتطبيق المعادلة :
الفاكتور الحقيقي المراد = الفاكتور الحالي * القيمة الحقيقية للعينة / القيمة المقروءة على الجهاز
الفاكتور الحقيقي المراد = 36.77 * 10.3 / 11 = 34.43
نقوم بتغيير الفاكتور على البرنامج من 36.77 إلى 34.43 .
ــــــــــــــــــ
** من خلال معرفتك للينياريتي الجهاز يمكنك حساب القيمة التي ستكون قراءة الجهاز صحيحة إذا وصل إليها في كل تحليل. وبعدها يعطي نتائج غير دقيقة .
اللينياريتي يعبر عنها بالامتصاص ، مثلا نقول هذا الجهاز لينيار حتى 1.5 امتصاصية. بالتالي إذا ضربنا هذا الرقم في فاكتور أي تحليل سنحوله إلى التركيز المقابل للينياريتي . أي أننا سنعرف كل تحليل لينيار كتركيز إلى رقم كذا الذي هو حاصل ضرب الفاكتور الخاص بهذا التحليل في لينياريتي الجهاز.
مع التنبه إلى أن قراءة البلانك لابد من حذفها من حدود اللينياريتي، بمعنى لو كان الجهاز لينيار حتى 1.5 وهناك تحليل يقرأ بلانك 0.2 فلابد من خصم قيمة البلانك من قيمة أبزوربانس اللينياريتي قبل أن نضرب في الفاكتور الخاص بهذا التحليل لحساب آخر تركيز لينيار له على الجهاز .
ــــــــــــــــ
في الخطوة السابقة استخدمنا الفاكتور الخاص بكل تحليل في تحديد أقصى تركيز لهذا التحليل يكون حقيقيا عندما يعطيه الجهاز دون تخفيف ، وذلك بالتعويض في المعادلة :
linear Conc = linear absorbance * Factor
هذا على أساس معرفتنا لـ linear absorbance الخاصة بالجهاز والتي هي أقصى قراءة absorbance يعطي الجهاز نتائج حقيقة إلى أن يصل إليها.
في حالة عدم معرفتنا بقيمة الـ linear absorbance يمكننا أنا نعين تلك القيمة باستخدام نفس المعادلة بشكل عكسي .
على هذا النحو:
linear Conc = linear absorbance * Factor
نشتق منها كيف نحدد قراءة linear absorbance فتصبح :
linear absorbance = linear Conc مقسوما على Factor
نلاحظ أن هذه المعادلة فيها ثلاثة أشياء: الـ Factor وهذا نأخذ قيمته من الجهاز ، وفيها linear absorbance وهذه هي القيمة التي نريد معرفتها ، وفيها linear Conc .
ولابد لمعرفة linear absorbance من معرفة linear Conc حتى نعوض بها في المعادلة .
السؤال الآن : كيف سنحدد قيمة linear Conc والتي هي أقصى قيمة تركيز حقيقية يعطيها الجهاز دون تخفيف ؟
والجواب: يمكننا تحديد هذه القيمة باستخدام محلول معلوم القيمة بالضبط standard عن طريق عمل تركيزات مختلفة معلومة من هذا المحلول ثم قياسها على الجهاز وتحديد أقصى تركيز يعطيه الجهاز صحيحا فيكون هو linear Conc ثم نعوض به في المعادلة السابقة ونحدد قيمة linear absorbance
من الأفضل لاختبار linear absorbance للجهاز أن يكون هذا على أكثر من فلتر ولا نكتفي بواحد فقط لأنه ربما يكون به عيب.
مثال للتوضيح:
تحليل السكر يتم قياسه على فلتر 546 ويعطي فاكتور تقريبا 300 وقيمة الاستاندر 100 يحضر بمزج 10 ميكرولتر من الاستاندر على 1 مل من الكاشف.
لاختبار linear absorbance سنقوم بتحديد linear Conc عن طريق تحضير تركيزات 200 و 300 و400 و 450 و500 باستخدام 20 و 30 و 40 و 45 و 50 من الاستاندر
ثم نقيس هذه التركيزات على الجهاز ، أقصى أنبوبة تعطي على الجهاز قراءة صحيحة للمحلول الذي تم تحضيره بها تكون هي linear Conc وبقسمتها على الفاكتور تعطي linear absorbance
فمثلا إذا أعطت أنبوبة 450 قراءة صحيحة وأعطت أنبوبة 500 قراءة غير صحيحة فإننا نحدد حينها linear Conc فيكون 450 ثم نقسمه على الفاكتور 300 فيعطينا linear absorbance = 1.5
*تحديد linear absorbance أمر ضروري جدا لا يمكن الاستغناء عنه وبدون معرفة هذه القيمة لا يمكن ضبط تحاليل الكينيتيك بشكل تام ..