Methods for Measurement of LDL-Cholesterol
الطرق المستخدمة في قياس البروتين الدهني منخفض الكثافة
LDL- C
----------------------------------------
📝 د / يونس الأهدل
-----------------------------------------
تتوزع نسبة الكوليستيرول الكلي في بلازما دم الانسان في المقام الأول بين ثلاث فئات رئيسية من البروتينات الدهنية هي :
1 - البروتين الدهني منخفظ الكثافة (LDL )
low-density lipoproteins (LDL )
2- البروتين الدهني منخفظ الكثافة جدآ
Very -low-density lipoproteins (VLDL)
3 - البروتين الدهني عالى الكثافة High-densit lipoproteine
( HDL)
وكميات قليلة من الكوليسترول ايضآ تتضمن في فئتين ثانوية هي:
1- البروتين الدهني المتوسط الكثافة
Intermediate-density lipoproteins ( IDL )
2- البروتين الدهني ( a )
lipoproteins ( a )
في الأشخاص الطبيعيين، يمكن ان تمثل فئة البروتينات الدهنية الثانوية حوالي 2 -4 mg/dl من اجمالي قيمة الكوليسترول المقاسة
وتمثل البروتينات الدهنية VLDL و HDL نسبة 20 -- 30% من اجمالي الكوليستيرول
بينما يمثل ال LDL معظم الكوليستيرول الموجوده في بلازما الدم بنسبة قد تصل من
60--70%
العلاقة بين الكولستيرول وخطر ألإصابة بأمراض القلب التاجية علاقة راسخة ومثبتة من قبل العديد من الدراسات مثل دراسة (فرمنغهام للقلب ).
ولأن معظم الكولستيرول في الدم ينقل بواسطة ال LDL-C فقد ثبت بشكل قاطع من قبل العديد من الدراسات والتجارب السريرية ان ال LDL-C هو المسؤل ألأول عن خطر ألإصابة بأمراض القلب التاجية ..
كما أوضحة هذة الدراسات أن المعالجة بمخفضات ال LDL-C
( LDL -C lowering thrapy )
يقلل من خطر ألإصابة بأمراض القلب التاجية ..
ونتيجة لهذه ألأسباب قامة مجموعة من الخبرأء في البرنامج التعليمي الوطني للكولستيرول
National Cholesterol Education Program
(NCEP)
بوضع مجموعة من التوصيات ، ركزت هذه التوصيات على إعتماد ال LDL-C كامؤاشر رئسي في تحديد مستوى الخطورة ، وتحديد جرعة العقاقير الازمة لانقاص مستوى ال LDL-C وبالتالي انقاص خطورة المرض القلبي الوعايئ
كما تضمنت هذة التوصيات مجموعة من المبادئ التوجيهية لتقدير ال LDL-C في المختبرات السريرية على انه يجب ان تكون الطرق المستخدمة في قياس ال LDL-Cفي حدود الروتين التالي للاداء :
Total error ≤ 12%
وهذا يتفق مع حدود الدقة والاحكام
Accuracy ± 4%
Precision(CV) ± 4%
⚫ الطرق المستخدمة في قياس ال LDL-C
----------------------------------------
توجد العديد من الطرق المعملية المستخدمة في قياس ال LDL-C
صنفة هذه الطرق اعتمادآ علي اساس العمل الي :
1 - طرق غير مباشرة
Indirect methods
2 - طرق مباشرة
Direct methods
☑ الطرق الغير مباشرة في قياس ال LDL-C تتضمن الطرق الاتية:
1 - طريقة الترسيب الفائق
Ultracentrifugation
B-quantification ( BQ)
تعتبر طريقة الترسيب الفائق اول طريقة ٱستخدمة في قياس ال LDL-C، على الرغم من ظهور طرق طرق حديثة في قياس ال LDL-C إلا أن طريقة الترسيب الفائق (BQ) ظلة وماتزال الطريقة المعيارية او المعيار الذهبي في قياس ال LDL-C
تحتاج طريقة الترسيب الفائق الي حجم كبير من العينة ، وتستهلك وقت طويل لإجرائها ، وكذالك تكلفتها المرتفعة ، كل هذة الأسباب وعلى الرغم من دقتها جعلتها غير مناسبة للاستخدام في المختبرات السريرية فقط بقي استخدامها في مختبرات الابحاث .
2 - معادلة فرايدوالد لحساب ال LDL-C
Friedewald’s formulas.
في عام 1972، قام Friedewald وآخرون. بنشرت تقريرا هاما واصفا صيغة (معادلة) لتقدير LDL-C كبديل لطريقة الترسيب الفائق (BQ)
هذه المعادلة كانت بالحقيقة لغرض استخدامها في الدراسات الوبائية، ولكن في وقت لاحق تبنة بسرعة وأصبحة الأسلوب المفضل من قبل المختبرات السريرية الروتينية، في جزء منه لأسباب اقتصادية
لاتحتاج هذة الطريقة سوى قياس الكوليسترول الكلي
T-Cholesterol ( TC)
و ال HDL-C و
Triglycerides (TG)
وهي كلها تتم في المختبر بشكل منولى دون الحاجة للترسيب الفائق المجهد والمكلف ، وبنآ علية يتم حساب قيمة ال LDL-C
في معادلة Freidwald يتم حساب ال LDL-C بطرح كل من ال VLDL-C و ال HDL-C من الكولستيرول الكلي TC كالتالي :
LDL-C=TC - HDL-C - VLDL-C
ووفقآ للمعادلة فإن تركيز ال VLDL-C سيحسب من خلال تقسيم ال TG على 5 إذا كان التقدير ب mg/dl او على 2.22 إذا كان التقدير ب mmol/dl ليصبح شكل المعادله الرئسي كالتالي:
LDL-C=TC - HDL-C - TG/5
إستخدام خمس ال TG كابديل عن ال VLDL-C في المعادلة مبعثة المشاهدات التي لاحظة أن نسبة كتلة الدهون الثلاثية TG إلى الكوليستيرول الموجوده في جزيئات VLDL-C هي نسبة ثابتة تقريبآ في الحالات الصيامية عند الأشخاص الأصحاء وهي تعادل 5:1
وهذا يعني أن تقدير ال VLDL-C وفق هذه المعادلة لن يكون دقيقآ في حالتين اثنين
في الحالات غير الصيامية ، وعندما يزيد تركيز ال TG عن 400 mg/dl نتيجة لاجود الدقايق الكيلوسية وبقاوتها
Chylomicrons remnants
وكذالك بقاوات البروتين الدهني منخفظ الكثافة جدا
VLDL remnants
في المصل ، وبالتالي فان نسبة ال TG/VLDL ستكون اكثر من 5:1 وسينجم عن ذالك ان تركيز ال VLDL في مثل هذة الحالات سيكون مبلغآ فية ، وسيكون تركيز ال LDL-C اقل من الحقيقي .
وهذا ما اثبتتة العديد من الدراسات من خلال المقارنة بين قيمة ال LDL-C المقاسة بواسطة الطريقة المعيارية BQ والمحسوبة بواسطة معادلة Freidwald
فقد اوضحة الدراسات ان نسبة الخطاء الاجمالي Total error بين الطريقتين المقاسة والمحسوبة كانت كالتالي :
1 - في مجموعة الامراض الذين لديهم تركيز لل TG يساوي من
200 - 300mg/dl
كانت نسبة الخطاء الاجمالي ≤10% وهو ضمن النسبة المسوح او الموصي بها من قبل لجنة الخبراء في البرنامج التعليمي الوطني للكوليستيرول (NCEP)
2- في مجموعة الامراض الذين لديهم تركيز لل TG من
300 - 400 mg/dl
كانت نسبة الخطاء الاجمالي من 13.8 - 15% هذه النسبة ليسة ظمن الحد المسموح بة لاكنها اقرب لتقابل الحدود الموصى بها
3- مجموعة الامراض الذين لديهم تركيز لل TG اكثر من 400mg/dl كانت نسبة الخطاء الاجمالي اكثر من 20% وبفارق كبير عن الحد الموصي بة
خرجت هذة الدراسات بجمله من التوصيات كان اهمها ان قياس ال LDL-C بالطريقة المحسوبة بواسطة المعادله غير دقيقة في الحالات الغير صيامية او عندما يكون تركيز ال TG اكثر من 400mg/dl وارجعة الاسباب االى الاسباب المذكورة سابقآ
---------------------------------------
ثانيآ
Direct Methods for measurements of LDL-C
الطرق المباشرة لقياس البروتين الدهني منخفظ الكثافة
----------------------------------------
1- First-Generation Methods
طرق الجيل الاول
⚫ طرق الترسيب الكيمائي
( chemical precipitation methods)
جرت عدة محاولات لتطوير طرق مناسبة للفصل المباشر لل LDL قبل ظهور التوصيات من قبل البرنامج التعليمي الوطني للكوليستيرول
كان اهم هذه الطرق هي طرق الترسيب الكيميائي
يتم ترسيب ال LDL-C بواسطة استخدام محاليل كيميايئة ثم يتم قياس ال LDL-C اما مباشرة من الراسب او غير مباشر كفارق بين قيمة الكوليستيرول الكلي في العينة و قيمة الكوليستيرول في الطافي كالتالي
ترسب جزيئات LDL بواسطة إضافة بعض محاليل مثل :
heparin at pH 5.12
كما في بعض الشركات او بواسطة
polyvinylsulfate
كماهو الحال في شركة روش
(Roche Diagnostics)
او بواسطة
unspecific amphiphatic polymers
كماهو الحال في شركة بايومريكس (BioMerieux)
او بواسطة
dextran sulfate
كما هو الحال في شركة بروجين
(Progen)
بعد إضافة المحلول يتم ترسيب جزيئات ال LDL بواسطة الطرد المركزي centrifugation
ثم تحسب قيمة ال LDL كافرق بين قيمة الكوليستيرول في المصل وقيمة الكوليستيرول في الطافى supernate
LDL = serumTC - supernate TC
او بواسطة قياس LDL في الراسب مباشرة
على الرغم من ظهور هذة الطريقة في ترسيب ال LDL في وقت مبكر
إلا أنها لم تحل كثيرآ محل معادلة
Friedewald
وبسبب ظهور هذه الطريقة مبكرآ قبل ظهور التوصيات من قبل البرنامج الوطني التعليمي للكوليستيرول NCEP
لا توجد ادلة قاطعة على أن هذة الطريقة لها مزايا ملموسة في الدقة ، أو الخصوصية .
بالإضافة إلي ذالك فأجود الاحماض الدهنية الحرة تتداخل سلبآ مع ترسيب ال LDL بواسطة ال dextran sulfate او polyvinylsulfate
كما أن اجود الدهون الثلاثية TG
باكثر من او يساوي 400mg/dl في المصل والمعروف أنة تؤثر سلبا على حساب Friedewald، تتداخل أيضا مع مع طريقة الترسيب الكيميائي
2 - second-generation methods
طرق الجيل الثاني
⚫ طريقة الفصل المناعي
an immunoseparation method
في العام 1994 اصبحة هذه الطريقة متوفر تجاريآ
يقاس ال LDL-C في هذه الطريقة مباشرة بعد تثبيط او حل البروتينات الدهنية غير ال LDL مناعيآ كالتالي
يحتوي المحلول على اجسام مضاده متعددة النسيلة مستخلصة من الماعز
polyclonal (goat) antibodies
للبروتين الدهني البشري
apo A-I and apo E
مرتبطة الي لاتكس
فعند اظافة العينه ترتبط الاجسام المضاده في المحلول بالبروتينات الدهنية chylomicrons, HDL,
VLDL, and IDL particles
في العينه لحلها او تثبيطها مما يسمح بقياس ال LDL مباشرة.
على الرغم من ان فصل ال LDL-C بهذه الطريقة يعتبر الي حدآ ما متخصص !
إلا أنة تم تحديد مقدار ضئيل من ال VLDL-C لم يتم حلها او تثبيطها و تقاس ضمن ال LDL-C
في العينات التي تكون فيها الدهون الثلاثية TG مرتفعة .
ومن جانب آخر فقد اكتشف آن
فقط من 75--80% من البروتين الدهني (Lp - (a
في العينة تقاس ضمن ال LDL-C
في الوقت الذي يفترض فية ان تكون هذه النسبة اكثر من 95%
هذة ألعوامل او ألأسباب وعلى الرغم من نسبها الضئيلة إلا انها مكنة من الحصول على فوارق بسيطة بالمقارنه مع الطريقة المعيارية BQ
حسب دراسات مقارنه
فقد اوضحة نتائج الدراسات ان قيمة ال LDL -C في ألأشخاص الطبيعيين ، وفي ألأشخاص الذين لديهم مستوي الدهون الثلاثية TG تتراوح بين اكثر او يساوي 200 إلي أقل او يساوي 400mg/dl كانت النتائج متطابقة في كلا الطريقتين ...
في ألأشخاص الذين كان لديهم مستوى الدهون الثلاثية TG أكثر من 400mg/dl كانت نتائج ال LDL -C تقابل او اقل من تلك التي حصل عليها بطريق ال BQ
وبنسبة خطي اجمالية تتراوح بين
( 11.5 -- 15%) هذه النسبة تعتبر ضمن او قريبة جدآ من نسبة الخطي المسموح بها من قبل البرنامج التعليمي الوطني للكوليستيرول NCEP 12%...
بلإضافة إلي مميزات الدقة ، والخصوصية في هذه الطريقة والتي تعتبر ضمن او قريبه جدأ من حدود الدقة والخصوصية الموصي بها كما اوضحته نتائج هذه الدراسات .. أضافة هذه الدراسات أيضآ ميزه اخري لهذه الطريقة وهي أنها لا تتاثر فيها قيمة ال LDL -C في الحالات الغير صيامية ..
وعلى الرغم من المميزات الاجابية في الدقة والخصوصية ، توجد مميزات سلبية أخري تقنية لهذه الطريقة وهي انها :
* تحتاج إلي حجم كبير من العينه * تحتاج إلي أدوات معينة لإجرائها * غير مناسبة للاستخدام في الأجهزة ألاتوماتيكية
Full automatic
* ومن الناحية ألإقتصادية تكلفتها المرتفعة
هذا السبب جعلها لا تحل كثيرآ محل حساب ال LDL -C بواسطة معادلة Freidwald
3 -Third-Generation Methods
طرق الجيل الثالث
⚫ طريقة القياس المتجانس (homogeneous assays)
او تسمي بالطرق الانزيمية
Enzymatic methods
في العام 1998 بداء ظهور القياسات المتجانسة او الطرق الانزيمية في قياس ال LDL-C
واستخدمة لأول مرة في اليابان
خمس من الطرق المتجانسة اصبحة متوفرة تجاريآ الان
1- Solubilization LDL-C assay (SOL; Kyowa Medex).
2- Surfactant LDL-C assay (SUR; Daiichi).
3- Protecting reagent LDL-C assay (PRO; Wako).
4- Catalase LDL-C assay (CAT; Denka Seiken).
5- Calixarene LDL-C assay (CAL; International Reagents Corporation).
يقاس ال LDL-C في هذه الطرق مباشرة دون الحاجة الي ترسيب او استخدام ادوات معينه
تحتوي المحاليل المستخدمه في هذه الطرق
يحتوي علي منظفات و مواد كيميايئة اخرى تعمل على حظر او إذابت فئة البروتينات الدهنية
Chylomicrons , VLDL-C ، HDL -C
وتسمح ببقاء البروتين الدهني LDL-C
ثم يقاس ال LDL-C انزيماتكلي مباشرة في نفس الكيوفيت
توزع المحاليل في علبتين R1و R2
,,يحتوي R1 علي المنظفات ويحتوي R2 على موادكيميايئه substrate
وتستخدم للاستخدام المباشرReady to used
دون الحاجة الي تحضير مسبق هذه الميزه و هذا التوزيغ يجعلها مناسبة للاستخدام مع مختلف اجهزة التحاليل الكيميايئة خصوصا الذي تعمل بشكل اتوماتيكي كامل .
ومن ناحية الدقة والخصوصية فقد اكدت نتائج دراسات مقارنة مع الطريقة المعيارة BQ
وكانت النتايج كالتالي
في مجموعة الاشخاص الذين لديهم مستوى الدهون الثلاثية من 200 -- 300mg/dl
كانت نسبة الخطاء الاجمالي تتراوح من 3.6 -- 6.8 % لمختلف الطرق
وفي الاشخاص الذي لديهم مستوى الدهون الثلاثية من
300---400mg/dl
كانت نسبة الخطى الاجمالي تتراوح بين 8---10%
هذه النسب تتعتبر ضمن الخطى المسموح به من قبل البرنامج التعليمي الوطني للكولستيرول 12%
وفي مجموعة الاشخاص الذين لديهم مستويات الدهون الثلاثية من 400mg/dl ----1000
كانت نسبة الخطى تتراوح بين 11.5-----14%
وبمتوسط 12.5%
هذة النسبة تعتبر ضمن او قريبة جدا جدا من نسبة الخطى المسموح به
مما يوكد ان هذه الطرقة دقيقة الي حدا ما او تقترب اكثر لتقابل مستويات الدقة والخصوصية المو صى بها كما انها لاتتاثر بوجود مستويات مرتفعة من الدهون التلاثية
بالاضافة الى ذالك انها لا تتاثر في العينات الغير صيامية هذه المميزات تجعلها امثر ملاءمة للمريض وطريقة سهلة للطبيب في متابعة وادارة الامراض الذين يعانون من ارتفاع الدهون في الدم
ومن ناعية تقنية مميزات الدقة والخصوصية بالاضافة الى انه سهلة الاجراء ولا تتطلب لوقت اكثر ولا تحتاج لاستخدام ادوات خاصة وقابليتها للاستخدم الاتماتيكي
ولا تحتاج الي حجم كبير من العينة ، يبقي هناك ميزه اقتصادية يجب ان تحققها حتى تحل محل معادل Freidwald
ليست هناك تعليقات:
إرسال تعليق